核酸分離提取的原則

核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。真核生物的染色體DNA為雙鏈線性分子，原核生物的“染色體”、質(zhì)粒及真核細胞器DNA為雙鏈環(huán)狀分子；有些嗜菌體DNA有時為單鏈環(huán)狀分子，RNA分子在大多數(shù)生物體內(nèi)均是單鏈線性分子，不同類型的RNA分子可以具有不同的結(jié)構(gòu)特點，如真核mRNA分子多數(shù)在3’端帶有poly(A)結(jié)構(gòu)，至于病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多種多樣，有雙鏈環(huán)狀、單鏈環(huán)狀、雙鏈線狀及單鏈線狀等。

95%的真核生物DNA主要存在于細胞核內(nèi)，其它5%為細胞器DNA，如線粒體、葉綠體等。RNA分子則主要存在于細胞質(zhì)中，約占75%，另有10%在細胞核內(nèi)，15%在細胞器中，RNA以rRNA的數(shù)量*多（80％-85%），tRNA及核內(nèi)小分子RNA占10%-15%，而mRNA分子大小不一，序列各異。總的來說，DNA分子的總長度一般隨著生物的進化程度而增大，而RNA的分子量與生物進化無明顯關(guān)系。

分離純化核酸總的原則：1.應保證核酸**結(jié)構(gòu)的完整性；2.排除其它分子的污染。

為了保證核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究，完整的**結(jié)構(gòu)是*基本的要求，因為遺傳信息全部貯存在**結(jié)構(gòu)之中，核酸的**結(jié)構(gòu)還決定其**結(jié)構(gòu)的形式以及和其它生物大分子結(jié)合的方式。對于核酸的純化應達到

以下三點要求：

1.核酸樣品中不存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；

2.其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應降到*低程度；

3.排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時應去除RNA，反之亦然。

為了保證分離核酸的完整性和純度，在實驗過程中，應注意以下事項：

1.盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞；

2.減少化學因素對核酸的降解，為避免過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH4-10的條件下進行；

3.減少物理因素對核酸的降解，物理降解因素主要是機械剪切力，其次是高溫。機械剪切力包括強力高速的溶液振蕩、攪拌，使溶液快速地通過狹長的孔道，細胞突然置于低滲液中，細胞爆炸式破裂以及DNA樣本的反復凍貯。這些操作細節(jié)在實驗操作中應倍加注意。機械剪切作用的主要危害對象是大分子量的線性DNA分子，如真核細胞的染色體DNA。對分子量小的環(huán)狀DNA分子，如質(zhì)粒DNA及RNA分子，威脅相對小些。高溫如長時間煮沸，除水沸騰帶來的剪切力外，高溫本身對核酸分子中的有些化學鍵也有破壞作用。核酸提取過程中，一般在低溫操作，但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)在室溫快速提取與低溫提取，獲得核酸的質(zhì)量沒有太大差異。

4.防止核酸的生物降解，細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的**結(jié)構(gòu)，其中DNA酶，需要金屬二價離子Mg2 、Ca2 的激活，使用EDTA、檸檬酸鹽螯合金屬二價離子，基本可以抑制DNA酶活性。而RNA酶不但分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿、不易失活，所以是生物降解RNA提取過程的主要危害因素。

核酸提取的主要步驟，無外乎破碎細胞，去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除鹽類，有機溶劑等雜質(zhì)，純化核酸等。核酸提取的方案，應根據(jù)具體生物材料和待提取的核酸分子的特點而定，對于某特定細胞器中富集的核酸分子，事先提取該細胞器，然后提取目的核酸分子的方案，可獲得完整性和純度兩方面質(zhì)量均高的核酸分子。