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磷酸化蛋白Western Blot的注意事項
日期:2024-11-22 01:49
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摘要:
磷酸化蛋白Western Blot的注意事項
關(guān)于/磷酸化蛋白樣品,裂解液問題
蛋白的磷酸化是一個非常迅速的反應(yīng),所以取樣品的過程要迅速,樣品要新鮮,樣品處理*好在冰上操作,操作時間盡量短。用PBS洗滌細(xì)胞時,PBS一定要4℃預(yù)冷。如果是組織的話,提取蛋白時采用液氮研磨的方法,研磨器具*好提前預(yù)冷,保持低溫的狀態(tài)。
提取磷酸化蛋白的裂解液*好是新鮮配制,裂解液中一定要有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑,否則即使條帶壓出來也會很淺,結(jié)果也...
磷酸化蛋白Western Blot的注意事項
- 關(guān)于/磷酸化蛋白樣品,裂解液問題
- 蛋白的磷酸化是一個非常迅速的反應(yīng),所以取樣品的過程要迅速,樣品要新鮮,樣品處理*好在冰上操作,操作時間盡量短。用PBS洗滌細(xì)胞時,PBS一定要4℃預(yù)冷。如果是組織的話,提取蛋白時采用液氮研磨的方法,研磨器具*好提前預(yù)冷,保持低溫的狀態(tài)。
- 提取磷酸化蛋白的裂解液*好是新鮮配制,裂解液中一定要有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑,否則即使條帶壓出來也會很淺,結(jié)果也不可信。okadaic acid,NaF是磷酸酶抑制劑。再者,還要看你檢測的蛋白磷酸化位點是什么氨基酸,如果是酪氨酸還要加1 u M的sodium vanidate即原釩酸鈉,上樣前不要煮沸,煮沸可能會破壞其磷酸化位點。
- 提取的磷酸化蛋白一定要妥善保存,*好是收集完成后馬上變性并于-80℃分裝保存,以保證降解程度*小。同時避免反復(fù)凍溶導(dǎo)致磷酸基團的降解。
- 關(guān)于/Western Blot操作問題
- 磷酸化蛋白的表達豐度較低,一般只有總蛋白量的10%,甚至更低,一定要確保每個凝膠孔中有足夠的目的蛋白上樣量。
- 磷酸化蛋白容易脫磷酸化,除提取蛋白時要迅速小心外,也可在上樣緩沖液和轉(zhuǎn)移緩沖液中加入磷酸化酶抑制劑Na3VO4等。
- 磷酸化抗體的好壞是一個關(guān)鍵因素,所以要選擇好的廠商。好抗體,傻瓜也能做出來,不好的抗體神仙也無辦法。有些公司的抗體很好,有些公司的抗體很差(一些大公司同樣會有低劣產(chǎn)品),而且這一點對非磷酸化的抗原檢測也很重要。
- 因為磷酸化蛋白只占總蛋白量的極少部分,加入一抗后*好4℃過夜,保證抗體有充分的結(jié)合時間。4℃也可以使一抗重復(fù)使用多次。畢竟磷酸化抗體都挺貴的。二抗則室溫1h即可。4℃過夜,主要原因不是使抗體結(jié)合更好,而是蛋白抗原不容易從膜上脫落。蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附屬熱力學(xué)范疇,高溫下容易脫落。而抗體-抗原結(jié)合是熱力學(xué)與動力學(xué)問題,高溫容易結(jié)合是熱力學(xué)范疇,抗體、抗原濃度卻是動力學(xué)范疇。膜上的抗原脫落了,結(jié)合效率會低。
- 磷酸化蛋白WB時,用洗滌液漂洗時也要注意一下,搖床的轉(zhuǎn)速不要太快,洗的時間不要太長,孵育一抗和二抗之后分別洗3次,每次5min即可。寧愿深一些,總比做不出來強得多。另外,洗的時候,*好不要把幾張膜疊在一起洗。
- 關(guān)于/磷酸化抗體的說明書
- 磷酸化抗體的說明書大家一定要仔細(xì)看,并*好根據(jù)廠商的操作說明來操作實驗,這是實驗成功的保證。因為不同的磷酸化抗體公司推薦的操作步驟不同。比如upstate的gamma-H2AX就需要脫脂奶粉封閉,一抗、二抗也需要脫脂奶粉配制;而CST的一些抗體則是脫脂奶粉封閉,一抗、二抗用BSA配制。其中原因不詳,但是應(yīng)該是非常關(guān)鍵的,我試過用BSA配gamma-H2AX,背景很高,目的條帶非常淡。
- 關(guān)于/WB時背景和條帶的問題
- 磷酸化蛋白WB時背景也往往較深,所以壓片時間要適當(dāng),不能太長或過短,太長則背景太深蓋住想要的那條帶,時間過短則可能沒有條帶或者條帶太淺。
- 洗滌液對*后的背景影響也較大,密理博(millipore)*近的說明書推薦用雙蒸水洗滌,我對比了TBST洗滌的膜,效果有一定差距,背景有效降低,即便壓片30min,背景仍然是可以忽略的。我想,雙蒸水充分減少了ECL反映中其他緩沖液的影響,應(yīng)該是可取的。
- 做磷酸化蛋白WB時,除了目標(biāo)蛋白的條帶以外,往往會出現(xiàn)非特異性的條帶。磷酸化抗體不好的話,甚至?xí)撼龇翘禺愋缘臈l帶,反而沒有你想要的條帶,所以壓片后,一定要根據(jù)Markers比對一下你壓出的條帶分子量是否正確。
- 關(guān)于/蛋白總的表達量問題
- 研究完某一蛋白的磷酸化情況后*好也要研究一下該蛋白總的表達量。這有兩種方法,一是:相同的樣品在不同的孔中上樣兩次(可在相同的膠上,也可在不同的膠上),其一壓磷酸化蛋白,另一壓該蛋白總的表達量(包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白),甚至還可跑另一個膠,壓內(nèi)標(biāo)。但是一般不建議如此做,因為這樣比較時誤差還是較大的。因此,比較公認(rèn)的,也是常用的方法,即用strip液將原先結(jié)合上的磷酸化抗體及二抗洗去,然后用同一張膜壓總蛋白。然后再洗脫一次,再壓內(nèi)標(biāo)。
- 關(guān)于/Strip時的問題
- Strip時一定要注意,膜一定要完全泡在strip solution中(可用較硬的塑料膜封好),然后要完全浸入水中,使受熱均勻。這一點很重要,要不然,隨后壓出來的總蛋白也好,內(nèi)標(biāo)也好就會不均一,無法進行比較。
- strip液是用來去除已結(jié)合的抗體,但也會去除部分的蛋白,導(dǎo)致蛋白信號變?nèi)?。實驗發(fā)現(xiàn)水浴有時溫度不穩(wěn)定,溫度定為55℃時往往其溫度容易超過,導(dǎo)致較多的蛋白也被去除,故建議溫度設(shè)為50℃,30min,既能有效去除已結(jié)合的抗體,又比55℃更能保護蛋白。